常见问题

解决方案

新购色谱柱如何活化

使用新色谱柱之前，****用 ****甲醇 30-40 倍柱体积进行冲洗活化。

如何过渡到流动相

先用流动相使用的有机溶剂冲洗 20-30 倍柱体积，将流动相中的缓冲盐换成水，冲洗 20-30 倍柱积，再用流动相冲洗 30-40倍柱体积。

如何过渡到流动相

先用流动相使用的有机溶剂冲洗 20-30 倍柱体积，将流动相中的缓冲盐换成水，冲洗 20-30 倍柱积，再用流动相冲洗 30-40倍柱体积。

使用完色谱柱如何冲洗保存

使用完色谱柱，先用乙腈：水=10:90 冲洗 60 倍柱体积，再用****乙腈冲洗 40 倍柱体积，保存于乙腈中，将色谱柱两头的堵头拧紧，放于盒中。若进行长期保存，定期将色谱柱拿出，用乙腈冲洗，保证色谱柱中的保存液不干涸。

三聚氰胺的主峰与杂质峰分不开

1 调整流动相比例，加大缓冲液的比例。C18 柱调整流动相至离子对试剂：乙腈=92：8，C8 柱调整流动相至离子对试剂：乙腈=90：10（液相方法）。2 将柱温设置于 40℃以上。

基线不平

1 平衡时间过短：延长平衡时间。

2 色谱柱污染：冲洗色谱柱。

3 色谱柱没有连接好，有漏液现象：检查连接情况。

4 液相仪器检测器污染：进行仪器维护。

5 液相仪器检测器氘灯能量过低：更换检测器氘灯。

主峰出现裂分，峰型较宽

1 溶剂效应：用国标方法溶解，降低溶解溶剂强度。

2 色谱柱污染：冲洗色谱柱，若严重污染，更换色谱柱。

3 色谱柱填料塌陷：维修或更换色谱柱。

4 液相仪器柱外效应过大：更换管路，减小柱外效应。

5 样品体积过大：用流动相配样，总的样品体积小于**峰

的 15%。

6 将色谱柱柱温过低：提高柱温。

色谱柱蛋白污染，如何再生

冲洗色谱柱方法：（前步无法将色谱柱再生，进行下一步）1%乙酸水溶液 →1%三氟乙酸水溶液 → 0.1%三氟乙酸：异丙醇=40:60 → NaCl，Na3PO4，Na2SO4 水溶液 0.5-1.0M (Na3PO4pH7.0) →DMSO：水=50:50/DMF：水=50:50。

压力不稳

1 泵内有空气：清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理。

2 比例阀失效：更换比例阀。

3 泵密封垫损坏：更换密封垫。

4 溶剂中有气泡：对溶剂脱气，必要时改变脱气方法。

5 系统漏液：找出漏点，密封。

6 梯度洗脱：压力波动是正常的。

7 单向阀堵塞：超声波清洗单向组件。

8 单向阀泄露：更换密封装置。

保留时间不稳定

1 柱温变化：保持恒定柱温。

2 等度与梯度间未能充分平衡：至少用 10 倍柱体积的流动相

平衡柱。

3 缓冲液容量不够：用>25mmol/L 的缓冲液。

4 柱污染：每天冲洗柱。

5 柱内条件变化：稳定进样条件，调节流动相。

6 柱快达到寿命：采用保护柱。

保留时间缩短

1 流速增加：检查泵，重新设定流速。

2 样品超载：降低样品进样量。

3 键合相流失，流动相 pH 值超出适用范围，色谱柱连接方向

错误。

4 流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀。

5 温度增加。

保留时间延长

1 流速下降：管路泄漏，更换泵密封圈，排除泵内气泡。

2 硅胶柱活性变化：可以用流动相改性剂，如加三乙胺，或

采用其它碱钝化色谱柱柱。

3 键合相流失：流动相 pH 值超出适用范围，色谱柱连接方向

错误。

4 流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀。

5 温度降低。

鬼峰

1 进样阀残余峰：用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗。

2 样品中未知物：处理样品。

3 柱未平衡：重新平衡柱，用流动相作样品溶剂（尤其是离

子对色谱）。

4 三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）：每天新配，用抗氧化剂。

5 水污染（反相）：通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC

级的水。

基线噪音

1 气泡（尖锐峰）：流动相脱气，加柱后背压。

2 污染（随即噪声）：清洗柱，净化样品，用 HPLC 级试剂。

3 检测器灯连续噪声：更换氘灯。

4 电干扰（偶然噪声）：采用稳定电源，检查干扰的来源（如

水浴等）。

5 检测器中有气泡：流动相脱气，加柱后背压。

峰拖尾

1 柱超载：降低样品量，增加柱直径或采用较高容量的固定

相。

2 峰干扰：清洁样品，调整流动相。

3 硅羟基作用：加三乙胺，用碱屏蔽硅羟基活性，增加缓冲

液或盐的浓度降低流动相 pH 值，钝化样品。

4 筛板堵塞：超声清洗或更换筛板，加在线过滤器过滤样品。

5 柱塌陷或形成短路通道：更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条

件。

6 死体积或柱外体积过大：尽可能采用细内径的连接管。

7 柱效下降：用较低腐蚀条件，更换柱或采用保护柱。

峰展宽

1 进样体积过大：用流动相配样，总的样品体积小于**峰

的 15%。

2 在进样阀中造成峰扩展：进样前后排除气泡以降低扩散。

3 数据系统采样速率太慢：设定速率应是每峰大于 10 点。

4 检测器时间常数过大：设定时间常数为**峰半宽的 10%。5 流动相粘度过高：增加柱温，采用低粘度流动相。

6 检测池体积过大：用小体积池，卸下热交换器。

7 保留时间过长：将连接管径和连接管长度降至小，采用

细内径管路。

8 柱外体积过大：将连接管径和连接管长度降至小，采用

细内径管路。9 样品过载：降低进样浓度，或减少进样体积。